大鼠MELK重組蛋白純化的一般流程
?前期準(zhǔn)備與蛋白表達(dá)?
將大鼠MELK目的基因克隆至帶His等親和標(biāo)簽的表達(dá)載體，導(dǎo)入大腸桿菌/293等適配宿主細(xì)胞。
培養(yǎng)宿主細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長期，加入誘導(dǎo)劑啟動(dòng)大鼠MELK重組蛋白的表達(dá)。
?細(xì)胞收獲與裂解?
離心收集誘導(dǎo)完成的宿主細(xì)胞，棄上清后用裂解緩沖液重懸細(xì)胞沉淀。
通過超聲破碎等方式充分裂解細(xì)胞，離心分離上清與沉淀，判斷大鼠MELK重組蛋白是可溶性表達(dá)還是形成包涵體。
?捕獲階段親和純化?
選用Ni-NTA等適配標(biāo)簽的親和層析柱，用平衡緩沖液充分平衡柱體。
將細(xì)胞裂解上清上樣，讓帶標(biāo)簽的大鼠MELK重組蛋白特異性結(jié)合層析介質(zhì)，用含低濃度咪唑的洗滌緩沖液洗去非特異性吸附的雜蛋白。
用高濃度咪唑的洗脫緩沖液洗脫目標(biāo)蛋白，收集大鼠MELK重組蛋白的洗脫組分。
?中度與精純階段?
可通過離子交換層析進(jìn)一步去除殘留雜蛋白，再經(jīng)凝膠過濾層析去除蛋白聚集體、置換緩沖液。
若實(shí)驗(yàn)需要去除標(biāo)簽，用TEV等特異性蛋白酶切割標(biāo)簽后，經(jīng)二次親和層析分離標(biāo)簽與目標(biāo)蛋白。
?質(zhì)量驗(yàn)證?
用SDS-PAGE電泳驗(yàn)證大鼠MELK重組蛋白的純度與分子量，通過Western Blot確認(rèn)目的蛋白身份。
采用BCA等方法測(cè)定蛋白濃度，分裝后低溫保存，完成整個(gè)純化流程。