牛雌二醇ELISA試劑盒常規(guī)檢測時長多在2~5小時，90分鐘快速檢測屬于優(yōu)化后的精簡操作方案，可在保證檢測準確性的前提下大幅壓縮實驗周期，以下是適配該試劑盒的90分鐘快速檢測完整操作方案。
一、實驗前置準備
?試劑與器材?
牛雌二醇(E2)ELISA試劑盒，需提前從2-8℃環(huán)境取出，室溫平衡20分鐘
450nm波長濾光片的酶標儀、高精度移液器、37℃恒溫箱、去離子水、吸水紙
?試劑預配置?
提前將20×濃縮洗滌液用去離子水稀釋為1×工作液，若有結(jié)晶可溫水浴溶解后再稀釋
按說明書比例提前配制生物素化抗體工作液、HRP酶結(jié)合物工作液，靜置5分鐘備用
?樣本預處理?
血清、血漿等樣本提前離心去除雜質(zhì)，按試劑盒要求完成預稀釋，確保樣本濃度落在檢測范圍內(nèi)
二、90分鐘快速檢測分步操作
?加樣與首次孵育（30分鐘）?
每孔加入100μL標準品梯度液或預處理后的待測樣本，空白孔不加樣
封板后置于37℃恒溫箱，避光孵育30分鐘，替代常規(guī)90分鐘的長時孵育
?第一次洗板（5分鐘）?
棄去孔內(nèi)液體，每孔加入350μL洗滌液，浸泡30秒后甩干，重復洗板3次
最后一次洗板后將酶標板倒扣在吸水紙上充分拍干，無可見殘留液
?加入生物素化抗體工作液孵育（20分鐘）?
每孔加入100μL生物素化抗體工作液，空白孔加入對應稀釋液
封板后37℃避光孵育20分鐘，替代常規(guī)60分鐘孵育時長
?第二次洗板（5分鐘）?
重復上述洗板操作，共洗板4次，充分去除未結(jié)合的游離抗體
?加入HRP酶結(jié)合物工作液孵育（15分鐘）?
每孔加入100μL HRP酶結(jié)合物工作液，空白孔加入對應稀釋液
封板后37℃避光孵育15分鐘，替代常規(guī)30分鐘孵育時長
?第三次洗板（5分鐘）?
重復洗板操作，共洗板4次，徹底清除未結(jié)合的酶標記物
?顯色與終止（10分鐘）?
每孔加入90μL TMB底物溶液，37℃避光孵育10分鐘，待液體出現(xiàn)明顯藍色梯度
每孔加入50μL終止液，輕輕晃動酶標板混勻，藍色立刻轉(zhuǎn)為黃色
?讀數(shù)與結(jié)果計算?
加入終止液后10分鐘內(nèi)，用酶標儀在450nm波長下測定各孔OD值
以標準品濃度為橫坐標、OD值為縱坐標繪制標準曲線，結(jié)合樣本稀釋倍數(shù)計算出牛雌二醇的實際濃度
三、快速檢測關(guān)鍵注意事項
所有試劑使用前必須充分搖勻，不同批號的試劑盒試劑禁止混用
快速孵育階段需嚴格控制37℃恒溫環(huán)境，避免溫度波動影響抗原抗體結(jié)合效率
洗板操作必須充分，避免洗滌不足導致本底偏高，影響快速檢測的結(jié)果準確性
該快速方案僅適用于科研場景，不得用于臨床診斷相關(guān)檢測